*1,3Peletiri, I. C., 1Ikeh, E. I., 2Nna, E., 3Ndike, U. P., 4Usman, Y. B., 5Durfa, L. D., 6Okonkwo, C. N., 7Murtala, R., and 2Nnajide, C. R.
1Department of Medical Microbiology, Faculty of Clinical Sciences, College of Health Sciences, University of Jos, Nigeria
2Safety Molecular Pathology Laboratory, The Molecular Pathology Institute, Enugu, Enugu State, Nigeria
3Medical Microbiology & Parasitology Laboratories, National Hospital, Abuja, Nigeria
4Public Health Laboratory, Ministry of Health, Kebbi, Kebbi State, Nigeria
5Microbiology Laboratory, Plateau State Specialist Hospital, Jos, Nigeria
6Medical Laboratory Department, Specialist Hospital, Sokoto, Sokoto State, Nigeria
7Medical Laboratory Services, Ahmad Sani Yariman Specialist Hospital, Gusau, Zamfara State, Nigeria *Correspondence to: kumochris@hotmail.com
Abstract:
Background: Following an increase in the practice of starting antimicrobial therapy prior to clinical sample collection, the ability to confirm pathogenic microorganisms of bacterial meningitis has decreased by approximately 30%. Culture results may be false negative when fastidious or culture-resistant bacteria are involved or when patient samples are obtained after antimicrobial therapy has started. Molecular diagnosis using PCR can be performed directly on clinical samples after metagenomic DNA (mDNA) extraction not requiring live organisms for a positive result. The specific objectives of this study are to perform mDNA extraction directly from cerebrospinal fluids (CSF) using appropriate spin column method, and to determine the quality of the mDNA elute.
Methodology: Cerebrospinal fluid specimens were collected from 210 patients with suspected acute cerebrospinal meningitis (CSM) in the Federal Capital Territory and some States in Northern Nigeria during the 2017 and 2018 outbreak seasons. Metagenomic DNA was extracted from approximately 200µL of CSF specimens using the Qiagen QIAamp(R) DNA Mini kit specific for bacterial agents only. DNA quality check was performed on all DNA elutes using fluorometric, spectrophotometric and agarose gel electrophoresis methods.
Results: Of the 210 CSF samples analyzed microbiologically, Gram reaction was positive in 94 cases (44.8 %) but only 17 (8.1 %) were culture positive for two of the three major bacterial causes of meningitis. One hundred and eighty (85.7%) samples had DNA concentrations ≥ 0.005 ng/µL, 55 (30.6 %) of these had DNA purity (A260/A280) of ≥ 1.7, 103 (57.2%) had purity value between 1.0 – 1.69, 14 (7.8%) had value of 0.57 – 0.99, and 8 (4.4%) failed purity evaluation with value of 0.00 at A260/A280.
Conclusion: The essence of mDNA extraction is multipurpose. A multiplex PCR can be performed on the extracted mDNA to interrogate the presence of microbial pathogens of interest using specific primers and probes (when applicable). Quality mDNA from CSF samples will ensure successful qPCR results for rapid and accurate detection of bacterial pathogens in meningitis. This will eliminate the challenges associated with traditional culture methods.
Keywords: Meningitis, CSF, DNA Quality Check, Fluorometry.
Received Jun 5, 2020; Revised Oct 8, 2020; Accepted Nov 4, 2020
Copyright 2021 AJCEM Open Access. This article is licensed and distributed under the terms of the Creative Commons Attrition 4.0 International License <a rel=”license” href=”//creativecommons.org/licenses/by/4.0/“, which permits unrestricted use, distribution and reproduction in any medium, provided credit is given to the original author(s) and the source. Editor-in-Chief: Prof. S. S. Taiwo
Qualité de l’ADN métagénomique extrait pour l’identification moléculaire des microorganismes à partir d’échantillons de LCR de patients suspectés de méningite cérébrospinale dans le nord du Nigéria
*1,3Peletiri, I. C., 1Ikeh, E. I., 2Nna, E., 3Ndike, U. P., 4Usman, Y. B., 5Durfa, L. D., 6Okonkwo, C. N., 7Murtala, R., et 2Nnajide, C. R.
1Département de microbiologie médicale, Faculté des sciences cliniques, Collège des sciences de la santé, Université de Jos, Nigéria
2Laboratoire de pathologie moléculaire de sécurité, Institut de pathologie moléculaire, Enugu, État d’Enugu, Nigéria
3Laboratoires de microbiologie médicale et de parasitologie, Hôpital national, Abuja, Nigéria
4Laboratoire de santé publique, ministère de la Santé, Kebbi, État de Kebbi, Nigéria
5Laboratoire de microbiologie, hôpital spécialisé du Plateau State, Jos, Nigéria
6Département de laboratoire médical, hôpital spécialisé, Sokoto, État de Sokoto, Nigéria
7Services de laboratoire médical, hôpital spécialisé Ahmad Sani Yariman, Gusau, État de Zamfara, Nigéria
*Correspondance à: kumochris@hotmail.com
Abstrait:
Contexte: Suite à une augmentation de la pratique de commencer un traitement antimicrobien avant le prélèvement d’échantillons cliniques, la capacité à confirmer les microorganismes pathogènes de la méningite bactérienne a diminué d’environ 30%. Les résultats de la culture peuvent être faux négatifs lorsque des bactéries exigeantes ou résistantes à la culture sont impliquées ou lorsque des échantillons de patients sont prélevés après le début du traitement antimicrobien. Le diagnostic moléculaire par PCR peut être réalisé directement sur des échantillons cliniques après extraction d’ADN métagénomique (ADNm) ne nécessitant pas d’organismes vivants pour un résultat positif. Les objectifs spécifiques de cette étude sont d’effectuer l’extraction de l’ADNm directement à partir des fluides céphalo-rachidiens (LCR) en utilisant la méthode de colonne de rotation appropriée, et de déterminer la qualité de l’élution d’ADNm.
Méthodologie: Des échantillons de liquide céphalo-rachidien ont été collectés auprès de 210 patients suspectés de méningite cérébrospinale aiguë (MSC) dans le Territoire de la capitale fédérale et dans certains États du nord du Nigéria au cours des saisons d’épidémie 2017 et 2018. L’ADN métagénomique a été extrait d’environ 200µL d’échantillons de LCR en utilisant le kit Qiagen QIAamp(R) DNA Mini spécifique pour les agents bactériens uniquement. Un contrôle de la qualité de l’ADN a été effectué sur tous les élues d’ADN en utilisant des méthodes d’électrophorèse sur gel fluorométrique, spectrophotométrique et d’agarose.
Résultats: Sur les 210 échantillons de LCR analysés microbiologiquement, la réaction de Gram était positive dans 94 cas (44,8%), mais seulement 17 (8,1%) étaient positives en culture pour deux des trois principales causes bactériennes de la méningite. Cent quatre-vingt (85,7%) échantillons avaient des concentrations d’ADN ≥ 0,005 ng/µL, 55 (30,6%) d’entre eux avaient une pureté d’ADN (A260/A280) ≥ 1,7, 103 (57,2%) avaient une valeur de pureté
comprise entre 1,0 et 1,69, 14 (7,8%) avaient une valeur de 0,57 à 0,99, et 8 (4,4%) ont échoué l’évaluation de la pureté avec une valeur de 0,00 à A260/A280.
Conclusion: L’essence de l’extraction d’ADNm est polyvalente. Une PCR multiplex peut être effectuée sur l’ADNm extrait pour interroger la présence d’agents pathogènes microbiens d’intérêt en utilisant des amorces et des sondes spécifiques (le cas échéant). Un ADNm de qualité provenant d’échantillons de LCR assurera des résultats de qPCR réussis pour une détection rapide et précise des bactéries pathogènes dans la méningite. Cela éliminera les défis associés aux méthodes de culture traditionnelles.
Mots clés: méningite, LCR, contrôle de la qualité de l’ADN, fluorométrie
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